EnzymAssay

(Bestimmung der Michaelis-Menten- Konstanten von beta-Galaktosidase)

Enzyme sind eine Klasse von Eiweißen, die in biologischen Systemen chemische Reaktionen katalysieren, weshalb sie auch als Biokatalysatoren bezeichnet werden. Eine wichtige Kenngröße zur Charakterisierung von Enzymen ist die Bindungsaffinität zum Substrat oder die Geschwindigkeit des Substratumsatzes. Die Michaelis-Menten-Konstante (KM) beschreibt die Substratkonzentration, bei der die Enzymreaktion mit halbmaximaler Geschwindigkeit (v_max/2) abläuft. Die meisten Enzymreaktionen sind, in Abhängigkeit von der Substratkonzentration, nullter oder erster Ordnung, d. h. bei genügend hohem Substratüberschuss wird die Geschwindigkeit der Reaktion nur durch die Konzentration des eingesetzten Enzyms bestimmt. Die Konzentration des Enzyms muss hierfür nicht bekannt sein.

Im diesem Experiment wird die KM des Enzyms beta-Galaktosidase aus einem E. coli Rohextrakt für das Substrat Ortho-Nitrophenyl-beta-D-galaktopyranosid (ONPG; Abb.1) experimentell bestimmt. ONPG ist ein ein Derivat des Disaccharids Laktose (Abb.1), dem natürlichen Substrat der beta-Galaktosidase.

Abb.:
Strukturformel von Laktose und ONPG. Der Pfeil gibt die Spaltstelle der β-Galaktosidase an.

Das Enzym beta-Galaktosidase dient im Stoffwechsel von E. coli dem Abbau von Laktose, indem es diesen Zucker in Glukose und Galaktose spaltet. Kodiert wird das Enzym durch das lacZ Gen, einem Strukturgen aus dem Laktose Operon von E. coli (Abb.2). Da Laktose als Energiequelle für E. coli von untergeordneter Bedeutung ist, wird das lacZ Gen nur in Anwesenheit von Laktose im Nährmedium exprimiert. Dies geschieht dadurch, dass Laktose in die Zelle aufgenommen wird und dort an ein regulatorisches Protein, den Laktose Repressor (Lac R), bindet und dadurch die Synthese der beta-Galaktosidase anschaltet. Man sagt auch, die Synthese wird durch Laktose induziert. Laktose ist also gleichzeitig Induktor und Substrat der beta-Galaktosidase.

Als Induktor der Genexpression kann auch ein nicht-metabolisierbares Derivat von Laktose eingesetzt werden, nämlich IPTG (Isopropyl-b-D-thiogalaktopyranosid). Dies erlaubt die Messung Enzymaktivität ohne störende Nebeneffekte, verursacht durch Laktose (Laktose wird zwar durch die beta-Galaktosidase gespalten, die Spaltprodukte können aber nicht nachgewiesen werden).

Da die Substratspezifität der beta-Galaktosidase niedrig ist, kann das bereits erwähnte ONPG als Substratanalogon von Laktose eingesetzt werden. Die Spaltung von ONPG lässt ein gelbes Reaktionsprodukt entstehen, dessen Menge photometrisch bei 420 nm bestimmt werden kann.

Abb.2: Prinzip der Induktion und Nachweis der β-Galaktosidase