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PCR als Schulexperiment

1. Einleitung

2. Grundlagen

3. Zeitschema

4. Materialien

5. Versuchsdurchführung

6. Ergebnis und Diskussion

7. Bezugsquellen

8. Literatur

9. Kostenübersicht

10. Zeit-Protokoll

11. Links zu Anwendungsbeispielen von Biopro-Logo


Vorbemerkung

Die Polymerasekettenreaktion (PCR)* entwickelte sich zu einer der wichtigsten Methoden in der Molekularbiologie. Diese und weitere molekularbiologische Arbeitsmethoden werden in verschiedenen Lehrbüchern der Biologie beschrieben [1] . Es soll ein PCR-Experiment gezeigt werden, das mit den an Schulen häufig vorhanden Experimentierkits, wie dem Lamda-Kit oder dem Blue Genes Kit durchgeführt werden kann. (1)(2)

*Die PCR ist patentrechtlich geschützt für Hoffmann-La Roche

Autor: StD Rudolf Heinze, Keltenstr.74/2 73773 Aichwald
Webbearbeitung: Ursula Gegler

1. Einleitung

Im Jahre 1992 erhielt Kary B. Mullis den Nobelpreis für die Erfindung der Polymerasekettenreaktion. Mit Hilfe der hitzestabilen Taq-Polymerase, welche aus in heißen Quellen lebenden Bakterien (Thermus aquaticus) isoliert wurde, wurde es möglich, einen bestimmenten Abschnitt einer DNA in kurzer Zeit millionenfach zu vermehren. Der

vervielfältigte Abschnitt kann dann durch Gelelktrophorese sichtbar gemacht werden oder für weitere Experimente, wie z.B. Klonierungsversuche weiter verwendet werden. Welcher Abschnitt vermehrt wird, bestimmt der Experimentator, indem er den gewünschten Bereich durch "Primer" eingrenzt. Primer sind kurze DNA-Stücke, die komplementär auf die Ziel-DNA passen.

Die PCR revolutionierte innerhalb kurzer Zeit die Molekularbiologie. Ungeahnte Möglichkeiten in der Verwendung öffneten sich. In der medizinischen Diagnostik können mit der PCR schnell und sicher Infektionen durch Viren, Bakterien, Pilzen oder Einzeller nachgewiesen werden sofern Bereiche ihrer Erbsubstanz bekannt sind. Da die PCR höchst sensitiv und schnell ist, kann z.B. das AIDS-Virus nachgewiesen werden lange bevor ein immunologischer Nachweis erfolgen kann . Auch in der Grundlagenforschung spielt sie eine dominierende Rolle, sei es bei der Sequenzanalyse, der gezielten Mutagenese oder sei es bei der zellunabhängigen Klonierung [2] [3] [4] . Weit mehr bekannt wurde die PCR durch die DNA-Analyse [5] . Durch gezieltes Vermehren von DNA-Abschnitten, die von Mensch zu Mensch verschieden lang sind, erhält man bei der anschießenden Gelelektrophorese bestimmte Muster vergleichbar einem Strichcode. In der Kriminalbiologie können so Täter, die irgend welche Zellen als Spuren hinterlassen haben, leicht identifiziert werden. Nach dem gleichen Prinzip werden Verwandtschaftsbeziehungen geklärt. Werden Bestandteile der Nahrung oder Kleidung auf die biologische Herkunft hin untersucht, bedient man sich auch der PCR.

Im folgenden Experiment wird mittels PCR die DNA des Bakteriophagen lambda nachgewiesen. Dazu wird ein 799 bp großes DNA-Fragment aus dem,Bakteriophagen vervielfältigt, durch Gelelektrophorese getrennt und dann durch Anfärben sichtbar gemacht. Lambda-Phagen-DNA eignet sich für Schülerversuche besonders gut, da diese DNA preisgünstig zu kaufen ist .

2. Grundlagen

Prinzip der PCR

Die Vervielfältigung eines Abschnitts aus einem DNA-Doppelstrang erfolgt in zyklischen Wiederholungen [7] [8] . Die spezifischen Primer (einzelsträngige Oligonukleotide aus 15 bis 30 Nukleotiden) bestimmen den zu vervielfältigenden Abschnitt. Bei jedem Zyklus erfolgt eine Verdoppelung des DNA-Abschnitts, d.h. nach 30 Kopien liegen 230 Kopien vor.

Die drei Teilschritte eines Zyklus sind:

a) Denaturieren: Trennen des DNA-Doppelstrangs bei 95 °C .

DNA-Doppelstrang

 

b) Hybridisieren: Anlagern (Annealing) der beiden Primer* an die DNA-Einzelstränge bei 58 °C. (Die Temperatur wird durch den Gehalt an G-und C-Nukleotiden der Primer bestimmt [7])

DNA-Doppelstrang

 

c) Polymerisieren (Extension): Ergänzung zu einem DNA-Doppelstrang durch die Taq-Polymerase bei 72 °C.

DNA-Doppelstrang

 

Im nächsten Zyklus werden die beiden DNA-Stränge wieder getrennt, die Primer angelagert und mittels Taq-Polymerase wieder zu DNA-Doppelsträngen ergänzt.

Die in genügender Menge vorliegenden DNA-Abschnitte können durch Elektrophorese getrennt und durch Anfärben sichtbar gemacht werden.

3. Zeitschema für den Versuchsablauf:

  Zeitbedarf

Anschließende Lagerung möglich bei minus 18°C

Zeit für Theorie

Vorbereitung der Reagenzien Vorbereitung des Arbeitsplatzes

15 min

   
Ansetzen der Stammlösungen

30 min

x

PCR Vorbereitung Wasserbäder oder Thermocycler

Auftauen der PCR-Komponenten

15 min

 
Pipettieren der PCR-Ansätze

15 min

 
PCR - Cycling mit Wasserbädern

50 min

x

(PCR - Cycling mit Thermocycler)

90 min

x

(90 min)

Elektrophorese Vorbereitung des Gels und der Proben

60 min

   
Auftragen der Proben auf das Gel

15 min

Elektrophorese mit Lambda-Kit, 25 - 30V

90 min

60 min

(Elektrophorese mit Blue Genes Koffer, 90V)

(30 min)

 
Färben und Entfärben des Gels

40 min

30 min

Tabelle 1: Zeitbedarf für den Versuch



4. Materialien

Aus dem "Blue Genes" Koffer oder dem Lambda-Kit werden verwendet (1)(2):

    • Elektrophoreseapparatur (Netzgerät und Kammer)
    • Eppendorf-Mikropipette (Blue Genes Koffer, 2-20 µl) bzw. Mikropipette (Lambda-Kit, 2,10 l)
    • DNA-Auftragspuffer
    • TBE-Elektrophoresepuffer oder TAE-Puffer
    • Agarose

Aus der zum "Blue Genes" Kit gehörenden Reagenzienbox stammen (3):

    • steriles Wasser (kann aber auch selbst hergestellt werden), AzurB-Chlorid (DNA-Färbemittel oder Färbemittel aus Lambda-Kit ; bzw. Sicherheitsfärbemittel von BIO-RAD (12)
    • DNA-Marker III (es kann aus Kostengründen darauf verzichtet oder ein anderer Längenstandard verwendet werden)(4)

Zusätzlich wird benötigt:

    • 70%-iger Spiritus (beim Färben mit Lambda-Kit)
    • 1 Mikropipette, 2-20 µl ( falls nur Lambda-Kit vorhanden)
    • Primer OF und OR (5)
    • Lambda-DNA (14)
    • Ready-Mix (enthält Taq-Polymerase, Puffer, MgCl2, Nukleotide) (13)(14)
    • Paraffinöl (mineral oil) (9)
    • Laborübliche Glasgeräte
    • PCR-Reaktionsgefäße ( 0,5 ml ) (8)
    • 3 Wasserbäder (95 °C, 62 °C, 72 °C). Dazu eine Pinzette und eine schwimmfähige Halterung aus einer 6 mm starken StyroporR-Tapetenisolierung (5 x 3 cm), in die mit einem Korkbohrer entsprechende Löcher gestanzt wurden. Alternativ: Thermocycler (7)
    • Stoppuhr
    • Sterilhandschuhe
    • Dampfdrucktopf zum Sterilisieren von Pipettenspitzen und Reaktionsgefäßen (in Bechergläsern, mit Abdeckung aus Alu-Folie )
    • Petrischale oder Styroporbox mit Eis
    • Netzgerät oder Batterien (wenn nur Lambda-Kit)
    • Ständer für Reaktionsgefäße (z.B. selbst gebastelt: Plexiglas- oder Hartschaumblock mit Bohrungen für die PCR-Reaktionsgefäße).

5. Versuchsdurchführung

5.1. Reaktionsansatz für die PCR

Hinweis: Steril arbeiten! Biochemikalien bei – 20 °C aufbewahren ! (Ready-Mix im Kühlschrank)

Entsprechend Tabelle 2 werden die Reaktionsansätze in die speziellen PCR-Gefäße pipettiert.

Nach Zusammenmischen aller Komponenten muss sofort mit dem Cycling (Wasserbäder oder Thermocycler) begonnen werden.

Die Stammlösungen sind berechnet für 10 Reaktionsansätze ( incl. Negativkontrolle, für 5 Arbeitsgruppen) und können nach Bedarf variiert werden. Auch wurde ein "Pipettierschwund" berücksichtigt.

Bis auf die Taq-Polymerase können die Lösungen rechtzeitig vorbereitet und bei – 20 °C längere Zeit aufbewahrt werden.

Auch wurde berücksichtigt, dass mit den einfachen Pipetten des Lambda-Kits nur 2 bzw. 10 µl abgemessen werden können.

Komponente Lieferumfang (Original) Vorbereitung der Stamm lösungen für 10 Reaktions ansätze Konzen tration der Stamm lösung Volumen pro PCR-Ansatz Volumen pro Negativ kontrolle End- konzen- tration für 50 µl Reaktions- ansatz [8]
READYMIX enthält Taq- Plolymerase, Puffer, Magnesium- chlorid und Nukleotide 500µl verteilen auf 20 PCR Reaktionsgefäße, die vom Praktikanten zu kennzeichnen sind 2x

25µl

25µl

1,5u Taq Pol., 10mM Tris-HCl, 1,5mM MgCl2 0,2mM dNTP
Primer 1 (links) 11,3nmol alles gelöst in 227 µl A.dest., davon 22 µl + 22µl A.dest., verteilen auf 10 Reaktionsgefäße

Kennzeichen: P1

25pmol/µl

2µl

2µl

1µM
Primer 2 (rechts) 12,4nmol alles gelöst in 248 µl A.dest., davon 22 µl + 22µl A.dest. verteilen auf 10 Reaktionsgefäße

Kennzeichen: P2

25pmol/µl

2µl

2µl

1µM
A.dest.

(Ergänzung zu 50 µl Ansatz)

     

19µl

(20µl)

21µl

(20µl)

 
Ziel DNA Bakteriophage Lambda 1u =50µg alles gelöst in 500 µl A.dest., davon 120 µl verteilen auf 10 Gefäße

Kennzeichen: L

100 ng/µl

2µl

-

200 ng pro 50 µl
Paraffinöl   mit der Tropfpipette je 2 große Tropfen (ca. 30 µl) auf 10 Gefäße verteilen

Kennzeichen: µl

 

ca.2Tr.

ca.2Tr.

 

Tabelle 2: Reaktionsansatz für die PCR

5.2. Durchführung der PCR

Unmittelbar nach Zugabe von Taq-Polymerase und Paraffinöl wird die eigentliche PCR gestartet, indem die beiden Reaktionsgefäße in den schwimmfähigen Halterungen schnell in das Wasserbad ( 95 °C ) gegeben werden. Der Wechsel der Wasserbäder nach Tabelle 3 muss eingehalten werden. Am besten fertigt man sich vorher ein Protokoll an (vgl. Anlage). Die Spitze der Reaktionsgefäße mit dem Reaktionsgemisch muss voll in das Wasser eintauchen.

 

Temperatur

Zeit

Reaktionsschritt

Zyklen

95 °C

2 min

Denaturieren

 

95 °C

20 s

Denaturieren

 

62 °C

30 s

Hybridisieren

25 x

72 °C

30 s

Polymerisieren

 

72 °C

5 min

Polymerisieren

 

15 °C

(wenn möglich 4°C, bzw. einfrieren)

bis zur Gelelektrophorese

   

Tabelle 3: Temperaturen und Zeiten der PCR

Alternativ kann die PCR in einem Thermocycler, der entsprechend dem Zeitplan programmiert wird, automatisch ablaufen.

5.3. Gelelektrophorese

Die Elektrophoresekammer wird nach Bedienungsanleitung mit 0,8%-igem Agarosegel in TBE-Puffer (Blue Genes: 1 %) gefüllt. Für das Beladen der Geltaschen werden folgende Lösungen zunächst hergestellt:

Spur 1

Spur 2

Spur 3

17 µl PCR-Ansatz

(20 µl bei Lambda-Kit)

17 µl Negativkontrolle

(20 µl bei Lambda-Kit)

8 µl Marker III

-

-

8 µl A.dest.

2 µl Auftragspuffer

2 µl Auftragspuffer

2 µl Auftragspuffer

Tabelle 4: Beladungsschema für die Gelelektrophorese

Durchführung der Elektrophorese:

    • Lambda-Kit: 90 min; 25 – 30 V
    • Blue Genes Kit: 25 min; 10 – 120 V

In beiden Fällen soll der Farbstoff-Marker 2/3 der Gellänge erreicht haben.

 

5.4. Färben und Entfärben des Gels nach entsprechender Anleitung.

Immer mit Schutzhandschuhen !

Blue Genes - Kit:

    • AzurB-Chlorid (1 ml ) mit 500 ml Wasser verdünnen; in eine Färbewanne geben.
    • Gel vorsichtig in die Färbewanne gleiten lassen; darin muss es mindestens 15 min bleiben.
    • Gel wird anschließend mehrmals mit entmineralisiertem Wasser entfärbt.

Nach 15 min sind die ersten Banden zu erkennen. Nach längerem Entfärben werden die Banden deutlicher.

Lambda-Kit:

    • Elektroden entfernen, Pufferlösung abgießen.
    • 1:1 (Aqua dest./ Färbelösungskonzentrat) verdünnte Färbelösung auf das Gel geben und 4 min dort belassen
    • Färbelösung entfernen und dann mit 70 %-igem Spiritus 30 s lang überschichten.
    • Spiritus verwerfen und dann mehrmals mit kaltem Leitungswasser übergießen.

Nach 10 min sind die ersten Banden sichtbar. Nach längerem Entfärben werden die Banden deutlicher.

 

6. Ergebnis und Diskussion

Die Abbildung zeigt ein gefärbtes Agarose-Gel mit dem Lambda Kit nach durchgeführter PCR mit 25 Zyklen

 

Abbildung Gel

Bild 1: Ergebnis PCR

Auswertung:

Spur 1: PCR – Fragment mit 799 bp, amplifiziert aus 200 ng DNA

Spur 2: Bei der Negativkontrolle ist erwartungsgemäß keine Bande zu erkennen

Spur 3: Ungeschnittene Lambda-Phagen-DNA in hoher Konzentration (ca. 1 µg/ 20 µl) Wie zu erwarten ist, wird die sehr große DNA (48500 bp) nicht richtig getrennt, da die Porengröße des 0,8 %-igen Gels für diesen Größenbereich nicht geeignet ist.

Spur 4: Die Banden des DNA- Markers entsprechen denen in der Abbildung im Handbuch zum Blue Genes Kit. Sie können den einzelnen Fragmentgrößen leicht zugeordnet werden.

Zusammenfassung:

Wie die neuen Lehrpläne* zeigen, gewinnt auch das Thema Gentechnik und Biotechnik zukünftig in der Schule größere Bedeutung. Mit den erwähnten Experimentier-Kits ist es möglich, dass Schüler einfache molekularbiologische Versuche durchführen können wie z.B. das Schneiden von DNA mittels Restriktionsenzymen und der Nachweis von DNA-Fragmenten durch Gelelektrophorese. Im vorliegenden Artikel wurde die Experimentierpalette durch die PCR* erweitert. Die PCR kann exemplarisch mit einfachen Mitteln und relativ preiswert durchgeführt werden.

*) z.B. Baden-Württemberg, Niedersachsen, NRW, Sachsen

 

7. Bezugsquellen

(1) Blue Genes Kit: Fonds der Chemischen Industrie Karlstr. 21, 60329 Frankfurt

(2) Lambda Kit: National Centre for Biotechnology Education (NCBE), University of Reading, Whiteknights, Reading, RG6 2AJ, United Kingdom, German Version

(3) Komplettes Reagenzienset für den Genbaukasten, bestellbar bei Roche Diagnostic Boehringer Mannheim GmbH, Molekular Biochemicals D-68298 Mannheim Tel 0800/759 2226

(4) DNA-Molekulargewichtsmarker III, Artikelnr. 528552, Einzeln bestellbar als Reagenz des Genbaukastens unter dem Stichwort "Blue Genes" bei Roche Diagnostic Boehringer Mannheim GmbH, Molekular Biochemicals D-68298 Mannheim Tel 0800/759 2226

(5) Die beiden

Primer links (5‘-3‘, 24 bp): GAC GGT GCT GGG TAC GGA AGT GAA A

Primer rechts (5‘-3‘, 24 bp): GTT CCA TAC CGG CAT ACA GCG CAT C kann man z.B. bei der Fa. amersham pharmacia biotech GmbH, Postfach 5480, D-79021 Freiburg synthetisieren lassen. oligo.ordering@eu.apbiotech.com . Auch können die Primer bei der Fa. SIGMA ARK (Fax: 0695 007 0306; sigma-ark@eurnotes.sial.com )synthetisiert werden.

Primer Design: Die Primer wurden mit dem über das Internet frei zugänglichen Programm konstruiert: (Primer 3), Center for Genome Research at the Whitehead Institute for Biomedical Research in Cambridge, Massachusetts, USA: http://www.genome.wi.mit.edu/ .Die Nukleotidsequenz des Lambda-Phagen ist über das Internet zu erhalten von: National Center for Biotechnology Information National Library of MedicineBuilding 38A, Room 8N805 Bethesda, MD 20894 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

(6) z.B. Core-System der Promega GmbH, High Tech Park, Schildkrötstr. 15, 68199 Mannheim oder entsprechendes Taq-DNA-Polymerase-Kit und dNTP-Mischung der Fa.Eppendorf GmbH, 22331 Hamburg auch bei Eppendorf vgl. (10)

(7) Es gibt sehr viele Anbieter: z.B. BIO-RAD laboratories GmbH, Postfach 450133, 80901 München, Biometra GmbH, Rudolf Wissell Str. 30, D-37079 Göttingen, Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Friedensstr.116, 51145 Köln

(8) z.B. Multiply-Pro, 500 m l, Best.Nr. 72.735, 500 Stck./Beutel,Preis ca. 60.- . Bestellbar bei Sarstedt AG & Co. , Postfach 1220, D-51582 Nümbrecht

( 9) Paraffinöl (mineral oil) Best.Nr. 69794, 100 ml, Preis ca. 20.-, Fluka Sigma-Aldrich Chemie GmbH Grünwaldweg 3, 82041 Deisenhofen

(10) Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Friedensstr.116, 51145 Köln

(13) Promega GmbH, High Tech Park, Schildkrötstr. .15, 68199 Mannheim

(14) Sigma-Aldrich GmbH, Eschenstr. 5, 82024 Taufkirchen

(15) Amersham Pharmacia Biotech GmbH, Postfach 5480, 79021 Freiburg

(16) Sigma Ark (Fax: 0695 007 0306; sigma-ark@eurnotes.sial.com )

 

8. Literatur

 

[ 1] H.BAYRHUBER – U.KULL: Linder Biologie.- 21. Aufl.- Hannover: Schroedel Verlag, 1998

[ 2] H.G. GASSEN – G.E. SACHSE – A. SCHULTE: PCR. – Stuttgart: Gustav Fischer, 1994

[ 3] TH. DINGERMANN – I. ZÜNDORF: Gentechnik Biotechnik. – Stuttgart: Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft 1999

[ 4] T. STRACHAN – A.P. READ: Molekulare Humangenetik - Heidelberg: Spektrum Akademischer Verlag 1996

[ 5] M. BENECKE – Kriminalbilologie. – Bergisch Gladbach: BLT 1999

[ 6] H. BAYRHUBER – E.R. LUCIUS: Handbuch der praktischen Mikrobiologie. Band 1. – Hannover: Metzler Schulbuchverlag 1992

[ 7] T.A. BROWN: Gentechnologie für Einsteiger.- Heidelberg: Spektrum Akademischer Verlag 1996

[ 8] PROMEGA: Technical Bulletin, Instructions for use of products M7660 and M7665. – Download Adresse: www.promega.com

 

9. Kostenübersicht

Kostenübersicht für die PCR (ca. in DEM ohne MWSt und Transport)

Zusätzlich zum vorhandenen Lambda-Kit bzw. Blue Genes Kit

Komponente Liefermenge ausreichend für wieviel PCR Preis pro Lieferung Verbrauch für 10 PCR Preis für 10 PCR Preis pro PCR
Ready Mix enthält Taq-Polymerase Puffer, MgCl2, Nukleotide (13)(14) 500 µl 20 30,40 250 µl 15,2 1,52
Lambda Phagen DNA Lyophilized (14) 1 unit

(ca. 50 µg )

250 35,00 2 µg 1,40 0,14
Primer (15)(16) 11,3 nmol 250 100 20 µl 4,00 0,4
PCR-Gefääße 0,5ml

Multiply Pro (8)

500   60.00   1,20 0,12
      225,00     2,1

 

(13) Promega GmbH, High Tech Park, Schildkrötstr. .15, 68199 Mannheim

(14) Sigma-Aldrich GmbH, Eschenstr. 5, 82024 Taufkirchen

(15) Amersham Pharmacia Biotech GmbH, Postfach 5480, 79021 Freiburg

(16) Sigma Ark (Fax: 0695 007 0306; sigma-ark@eurnotes.sial.com )

 

10. Zeitprotokoll

Zyklus     min

s

    Zyklus     min

s

 
Start

°C

 

0

0

ok

   

°C

     

ok

 

95

bis

2

0

               

1

95

bis

2

20

   

14

95

bis

19

40

 
 

62

bis

2

50

     

62

bis

20

10

 
 

72

bis

3

20

     

72

bis

20

40

 

2

95

bis

3

40

   

15

95

bis

21

0

 
 

62

bis

4

10

     

62

bis

21

30

 
 

72

bis

4

40

     

72

bis

22

0

 

3

95

bis

5

0

   

16

95

bis

22

20

 
 

62

bis

5

30

     

62

bis

22

50

 
 

72

bis

6

0

     

72

bis

23

20

 

4

95

bis

6

20

   

17

95

bis

23

40

 
 

62

bis

6

50

     

62

bis

24

10

 
 

72

bis

7

20

     

72

bis

24

40

 

5

95

bis

7

40

   

18

95

bis

25

0

 
 

62

bis

8

10

     

62

bis

25

30

 
 

72

bis

8

40

     

72

bis

26

0

 

6

95

bis

9

0

   

19

95

bis

26

20

 
 

62

bis

9

30

     

62

bis

26

50

 
 

72

bis

10

0

     

72

bis

27

20

 

7

95

bis

10

20

   

20

95

bis

27

40

 
 

62

bis

10

50

     

62

bis

28

10

 
 

72

bis

11

20

     

72

bis

28

40

 

8

95

bis

11

40

   

21

95

bis

29

0

 
 

62

bis

12

10

     

62

bis

29

30

 
 

72

bis

12

40

     

72

bis

30

0

 

9

95

bis

13

0

   

22

95

bis

30

20

 
 

62

bis

13

30

     

62

bis

30

50

 
 

72

bis

14

0

     

72

bis

31

20

 

10

95

bis

14

20

   

23

95

bis

31

40

 
 

62

bis

14

50

     

62

bis

32

10

 
 

72

bis

15

20

     

72

bis

32

40

 

11

95

bis

15

40

   

24

95

bis

33

0

 
 

62

bis

16

10

     

62

bis

33

30

 
 

72

bis

16

40

     

72

bis

34

0

 

12

95

bis

17

0

   

25

95

bis

34

20

 
 

62

bis

17

30

     

62

bis

34

50

 
 

72

bis

18

0

     

72

bis

35

20

 

13

95

bis

18

20

    Ende

72

bis

40

20

 
 

62

bis

18

50

               
 

72

bis

19

20