Inhaltsstoffe der Milch
Versuch 1: Fällung und Auftrennung der Milchproteine
Grundlagen
Milchproteine bestehen zu 80 % aus Casein und 20 % aus Molkeproteinen (Albumine und Globuline). Diese beiden Fraktionen unterscheiden sich in ihren Eigenschaften. Während die Caseine bei einer Senkung des pH-Werts oder durch Labenzym schnell ausflocken, treten die Molkeproteine bei einer Erhöhung der Temperatur zu sichtbaren Aggregaten zusammen. Dieser Fakt kann für eine Auftrennung genutzt werden.
Materialien
- Milch
- dest.Wasser
- Essigsäure (w = 10 %),
- Natriumcarbonat
- 1 Becherglas (250 ml)
- Glasstab, Messzylinder (100 ml)
- Tropfpipette, Thermometer
- 2 Trichter und 2 Faltenfilter
- 2 Erlenmeyerkolben (100 ml)
- pH-Messgerät
- Heizplatte, Spatel
- 6 Reagenzgläser für folgende Versuche
Sicherheit
Essigsäure ist ätzend, Schutzbrille tragen.
Vorsichtiges Erhitzen der Molke, Siedesteine verwenden.
Vorsicht beim Umgang mit sensibler pH-Elektrode.
Durchführung
- 25 ml Vollmilch werden mit 25 ml dest. Wasser versetzt und auf 40 °C erhitzt.
- Unter Rühren wird tropfenweise Essigsäure mit w = 10 % zugegeben, bis ein pH-Wert von 4,6 erreicht ist. Die Milch gerinnt.
- Das Gemisch wird einige Minuten stehen gelassen. Anschließend wird der Niederschlag über einen Faltenfilter abfiltriert.
Der Niederschlag besteht aus Casein und etwas Milchfett, welches bei dem Verfahren mit ausgefällt wird.
Bei dem klaren Filtrat handelt es sich um die Molke. Sie ist schwach sauer, enthält alle Inhaltsstoffe der Milch außer Casein. - Das Filtrat wird mit einigen Spatelspitzen Natriumcarbonat auf einen pH-Wert ≈ 6 eingestellt.
- Die Lösung wird dann auf der Heizplatte vorsichtig aufgekocht (Siedesteine benutzen). Sie schäumt auf und die Molkeproteine flocken aus.
- Molkeproteine werden über einen Faltenfilter abfiltriert.
Das klare Filtrat ist die Molke. Sie ist proteinfrei und wird für die folgenden Versuche aufbewahrt.
Hinweis
Für die Nachweisreaktionen
Verteilung der Caseine (Niederschlag in Schritt 3) und der Molkeproteine (Niederschlag in Schritt 6): Sie werden auf jeweils 3 Reagenzgläser 1 bis 3 verteilt.
Versuch 2: Nachweise der Proteine
2.1 Biuret-Reaktion
Grundlagen
Gibt man zu der Proteinaufschlämmung die gleiche Menge verdünnter Natronlauge und fügt anschließend wenige Tropfen einer Kupfersulfat-Lösung (Fehling I) hinzu, kommt es zu einem hellblauen Niederschlag, der beim Schütteln zu einer Violettfärbung führt.
Mit Proteinen und Peptiden mit mindestens zwei Peptidgruppen entsteht ein violetter Kupfer(II)-Komplex.
Materialien
- Reagenzglas 1 mit Casein aus Versuch 1
- Reagenzglas 1 mit Molkeproteinen aus Versuch 1
- Natronlauge (w = 4 %)
- Kupfersulfat-Lösung (Fehling I)
- Glycin-Lösung
- Tyrosin-Lösung
- Harnstoff-Lösung
- Messzylinder (10 ml)
- Tropfpipette
- 3 Reagenzgläser
- Reagenzglasgestell
Sicherheit
Natronlauge ist ätzend, Schutzbrille tragen.
Kupfersulfat-Abfälle in Schwermetallabfall-Behälter geben.
Durchführung
- Casein im Reagenzglas 1 wird mit wenig Wasser (ca. 3 ml) aufgeschlämmt.
- Zugabe von ca. 3 ml Natronlauge zur Aufschlämmung
- Zugabe von 3 – 4 Tropfen Kupfersulfat-Lösung (Fehling I). Anschließend wird geschüttelt und evtl. etwas erwärmt.
- Wiederholung der Schritte 1 bis 3 mit Molkeprotein, den Aminosäure-Lösungen und der Harnstoff-Lösung.
2.2 Xanthoprotein-Reaktion
Grundlagen
Aromatische Aminosäuren und Proteine, die aromatischen Aminosäuren in der Peptidkette enthalten, werden nachgewiesen.
Hierzu erhitzt man die Protein-Aufschlämmung, die Aminosäure-Lösungen und die Harnstoff-Lösung mit Salpetersäure.
Die Gelbfärbung geht auf eine Nitrierung der aromatischen Ringsysteme zurück, die auch bei unsauberem Arbeiten mit Salpetersäure auf der Haut beobachtet werden kann.
Materialien
- Reagenzglas 2 mit Casein aus Versuch 1
- Reagenzglas 2 mit Molkeprotein aus Versuch 1
- Glycin-Lösung
- Tyrosin-Lösung
- Harnstoff-Lösung
- Salpetersäure konzentriert
- 3 Reagenzgläser
- Reagenzglasgestell
- Messzylinder (10 ml)
- Heizplatte
- Wasserbad
Sicherheit
Vorsicht: Salpetersäure ist ätzend, Schutzbrille tragen.
Durchführung
- Casein im Reagenzglas 2 wird mit wenig Wasser aufgeschlämmt.
- Zugabe von ca. 3 ml konzentrierte Salpetersäure, eventuell wird leicht erwärmt.
- Wiederholung der Schritte 1 und 2 mit Molkeproteinen, den Aminosäure-Lösungen und der Harnstoff-Lösung.
2.3 Ninhydrin-Reaktion
Grundlagen
Der Nachweis funktioniert bei Peptiden mit freien Aminogruppen, also nicht bei Prolin, aber z. B. auch sehr schlecht bei langkettigen Peptiden, da es hier wenig freie Aminogruppen gibt. Die Aminogruppe reagiert über Ammoniak mit Ninhydrin. Es entsteht der blau-violette Farbstoff.
Materialien
- Reagenzglas 3 mit Casein aus Versuch 1
- Reagenzglas 3 mit Molkeprotein aus Versuch 1
- Glycin-Lösung
- Tyrosin-Lösung
- Harnstoff-Lösung
- Ninhydrin-Lösung (w = 1 % in Propan-2-ol)
- 3 Reagenzgläser
- Tropfpipetten
- Heizplatte
- Messzylinder
Sicherheit
Ninhydrin von Zündquellen fernhalten.
Durchführung
- Casein im Reagenzglas 3 wird mit wenig Wasser aufgeschlämmt.
- Zugabe von wenigen Tropfen Ninhydrin-Lösung.
- Einige Minuten warten oder im Wasserbad erhitzen.
- Wiederholung der Schritte 1 bis 3 mit Molkeprotein, den Aminosäure-Lösungen und der Harnstoff-Lösung.
Beobachtung
Füllen Sie die Tabelle aus, indem Sie Ihre Beobachtungen notieren.
zu untersuchende Substanz |
Casein |
Molkeprotein |
Tyrosin |
Glycin |
Harnstoff |
Biuret-Reaktion |
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Xanthoprotein-Reaktion |
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Ninhydrin-Reaktion |
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Versuch 3: Nachweise der Mineralstoffe in der Molke
Grundlagen
Milch enthält Mineralstoffe. Die Konzentration an Calcium, Kalium, Chlorid und Phosphat liegen im Bereich von 1 bis 3 g/l.
Diese Ionen können einfach nachgewiesen werden. Eiweiße in der Probe können die Nachweise stören, da sie beim Zusatz von Säure, Ionen (Aussalzen, Fällung), und bei einer Erhöhung der Temperatur ausflocken bzw. durch Zugabe konzentrierter Salpetersäure nitriert werden (Xanthoprotein-Reaktion). Deshalb empfiehlt es sich, mit der eiweißfreien Molke zu arbeiten.
3.1 Nachweis von Ca2+-Ionen
Vorversuch 3.1.1 Denaturierung von Casein mit Hilfe von Lab
Grundlagen
Die Caseinfällung mit Hilfe von Lab ist nur bei Anwesenheit von Ca2+-Ionen möglich.
Durch die Labenzyme treten die Caseinmicellen zu sichtbaren Aggregaten zusammen. Sogenannte Calciumphosphatverbrückungen halten die einzelnen Submicellen sowie die Caseinmicellen zusammen. Casein fällt aus.
Materialien
- Lab-Lösung
- Milch
- Ammoniumoxalat-Lösung (w = 5 %)
- 2 Reagenzgläser
- Reagenzglasgestell
- Messzylinder (10 ml)
Durchführung
- In Reagenzglas 1 werden 5 ml Milch gegeben und 5 ml Lab-Lösung.
- In Reagenzglas 2 werden 5 ml Milch + 5 ml c + 5 ml Ammoniumoxalat-Lösung gegeben.
Beobachtung und Ergebnis
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RG 1 |
RG 2 |
Fällung von Casein |
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Ergebnis |
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Versuch 3.1.2 Qualitativer Nachweis von Calcium
Grundlagen
Ca2+-Ionen reagieren mit Ammoniumoxalat-Lösung. Dabei entsteht schwerlösliches Calciumoxalat.
Materialien
- Molke aus Versuch 1.1 (MolkeV1)
- Molke aus gekaufter Molke (Molke M)
- Molke aus der Lab-Gerinnung (MolkeL)
- Ammoniumoxalat-Lösung (w = 5 %)
- 3 Messpipetten (5 ml)
- 3 Reagenzgläser
- Reagenzglasgestell
- Tropfpipetten
Durchführung
- Jeweils 5 ml Molke werden in je ein Reagenzglas gegeben.
- Zugabe von jeweils 20 Tropfen Ammoniumoxalat-Lösung zu jeder Probe.
Beobachtung
Bei Anwesenheit von Ca2+-Ionen bildet sich ein feiner weißer Niederschlag.
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Molke aus V 1 |
Molke aus gekaufter Molke |
Molke aus Lab-Gerinnung |
destilliertes Wasser |
Zugabe von Ammonium-oxalat-Lösung |
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Ergebnis
Erklärung
Versuch 3.1.3 Quantitative Bestimmung der Ca2+-Ionen durch komplexometrische Titration mit EDTA
Grundlagen
Bei der komplexometrischen Titration erfolgt die Bestimmung des jeweiligen Kations durch Komplexbildung.
In Komplexverbindungen wird das Zentralatom oder Zentral-Ion (in diesem Fall Ca2+) von anderen Atomen oder Molekülen (in diesem Fall EDTA) umgeben und ist fest gebunden.
Um den Äquivalenzpunkt der Titration zu erkennen, wird ein Metallindikator zugegeben (Eriochromschwarz), der mit Ca2+-Ionen einen weinroten Calcium-Indikatorkomplex bildet.
Am Anfang der Reaktion sind also praktisch die Ca2+-Ionen an den Indikator gebunden. Bei Zugabe von EDTA wird das Ca2+-Ion aus dem Indikatorkomplex herausgelöst und an EDTA gebunden.
Am Äquivalenzpunkt verfärbt sich die weinrote Lösung grau-grün. Da diese Reaktion bevorzugt im alkalischen Milieu stattfindet, wird Ammoniak-Lösung zugegeben.
Materialien
- EDTA-Lösung (Titriplex III, c = 0,01 mol/l)
- Ammoniaklösung konzentriert
- Indikatorpuffertabletten
- 100 ml MolkeV1 ,1 : 10 verdünnt
- 100 ml MolkeM 1 : 10 verdünnt
- MolkeL
- Messzylinder (100 ml)
- 3 Erlenmeyerkolben (300 ml)
- Stativ + Stativmaterial
- Bürette
- Glastrichter
- Messpipette 1 ml
Sicherheit
Ammoniak ist ätzend und giftig, Schutzbrille und unter dem Abzug arbeiten.
Durchführung
- 100 ml der 1 : 10 verdünnten MolkeV1 in den Erlenmeyerkolben geben.
- Indikatortablette darin auflösen.
- 1 ml konzentrierten Ammoniak zugeben.
- Titrationsapparatur aufbauen, mit EDTA-Lösung befüllen.
- Bis zum Äquivalenzpunkt titrieren.
- Wiederholung mit verdünnter MolkeM aus gekaufter Molke und MolkeL (unver-dünnt) aus der Labgerinnung.
Beobachtung
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MolkeV1 |
MolkeM |
MolkeL |
V(EDTA) in ml |
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c(Ca2+) |
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Ergebnis
c(Ca2+) = VT cT/V (Molke)
VT = Verbrauch an Titriplex III
cT = Stoffmengenkonzentration an Titriplex III = 0,01 mol/l
Hinweis
Bei den verdünnten Molken muss das Ergebnis mit dem Faktor 10 multipliziert wer-den.
Erklärung
Hinweis: 100 g Milch (3,5 % Fett) enthalten 120 mg Ca2+-Ionen.
3.2 Nachweis von Phosphat
Materialien
- Molke (aus V1), MolkeM, MolkeL
- Ammoniummolybdat-Lösung (w = 5 %)
- Salpetersäure verdünnt
- Reagenzglas, Reagenzglasgestell
- Messpipetten (5 ml, 2 ml)
- Tropfpipette
- Heizplatte, Wasserbad
Sicherheit
Salpetersäure ist ätzend, Schutzbrille tragen.
Durchführung
- 5 ml der jeweiligen Molke werden in je ein Reagenzglas gegeben.
- Zugabe von jeweils 2 ml verdünnter Salpetersäure und 10 Tropfen Ammonium-molybdat-Lösung.
- Erwärmung im Wasserbad.
Beobachtung
Bei Anwesenheit von Phosphat-Ionen bildet sich ein gelber Niederschlag von (NH4)3[P (Mo3O10)4] aq.
Ergebnis
3.3 Nachweis von Vitamin B2
Grundlagen
Milch ist ein wichtiger Lieferant von Vitamin B2 (Riboflavin). Das Vitamin kann in der Molke durch seine gelb-grüne Fluoreszenz im UV-Licht nachgewiesen werden.
Materialien
- 10 ml mobile Phase: Eisessig/Wasser (v/v 1 : 1)
- stationäre Phase: Kieselgel, SIL GUV254 nm
- Molke
- Riboflavin-Lösung als Vergleichslösung
- Kapillaren (10µl)
- Chromatografiegefäß
- 2 Messpipetten (5 ml)
- UV-Lampe, Fön
Sicherheit
Eisessig ist ätzend, Schutzbrille tragen.
UV-Licht führt zu Verbrennungen auf der Haut und in den Augen.
Nicht ins UV- Licht schauen. Bei längerem Arbeiten Schutzhandschuhe tragen.
Durchführung
- Das Chromatografie-Gefäß wird mit je 5 ml Eisessig und 5 ml Wasser befüllt und verschlossen.
- Die DC-Platte wird vorbereitet, indem eine Startlinie und auf der Startlinie zwei Auftragungspunkte 1 und 2 mit Bleistift markiert werden. Die Beschichtung darf dabei nicht zerstört werden.
- Auftragen von 5 – 10 µl der Vergleichslösung auf den Auftragungspunkt 1 mit Hilfe der Kapillare.
Mit einer zweiten Kapillare wird die Molke auf den Auftragungspunkt 2 aufgetragen. - Das Chromatogramm wird vorsichtig in das Chromatografiegefäß gestellt.
- Wenn das Fließmittel 2/3 der DC-Platte durchlaufen hat, werden das Chromatogramm entnommen, die Fließmittelfront markiert und die DC-Platte mit dem Fön getrocknet.
- Zum Nachweis von Riboflavin wird die DC-Platte unter UV-Licht (366 nm) gelegt.
Beobachtung
Hinweis: Gleiche Stoffe laufen unter gleichen Bedingungen gleich weit.
Ergebnis
Bestimmung der Rf-Werte von Riboflavin
3.4 Nachweis von Milchzucker (Lactose)
3.4.1 Nachweis von reduzierenden Zuckern mit Fehling
Grundlagen
Das Disaccharid Lactose kommt ausschließlich in Milch und Milchprodukten vor. Es ist die Hauptkomponente der Kohlenhydratfraktion in der Milch. In geringen Mengen enthält Milch auch Glucose.
Abbildung: Lactose
In der Lactose sind D-Galactose und D-Glucose ß-1,4-glycosidisch verknüpft. Aufgrund der freien OH-Gruppe reduziert Lactose Fehling-Lösung. In wässriger Lösung bilden sich α- und ß-Lactose im Verhältnis 2: 3 aus. Lactose wird bei der Herstellung vieler Sauermilchprodukte mikrobiell zu Milchsäure umgesetzt.
Materialien
- Molke V1
- Joghurt
- Fehling I und II
- Reagenzglas
- Molke aus lactosefreier Milch
- 3 Reagenzgläser
- Reagenzglasgestell
- Heizplatte, Wasserbad
- Messpipetten (5 ml, 1 ml)
Sicherheit
Fehling I enthält die Schwermetall-Ionen Cu2+, Entsorgung im Schwermetallabfall.
Durchführung
- 5 ml Molke werden in einem Reagenzglas mit je 1 ml Fehling Lösung I und II versetzt.
- Ein Spatellöffel Joghurt wird in einem Reagenzglas mit ca. 5 ml Wasser aufgeschlämmt. Anschließend werden je 1 ml Fehling I und II zugegeben.
- Molke aus lactosefreier Milch wird in einem Reagenzglas mit je 1ml Fehling I und II versetzt.
- Alle drei Reagenzgläser werden vorsichtig im Wasserbad erhitzt.
Beobachtung und Ergebnis
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Molke |
Joghurt |
Molke aus lactosefreier Milch |
Fehlingsche Probe |
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Ergebnis |
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3.4.2 Nachweis von Lactose durch Dünnschichtchromatografie
Grundlagen
Lactose kann spezifisch mit Hilfe der Dünnschichtchromatografie nachgewiesen werden.
Materialien
- 2 ml MolkeV1 in 10 ml Propan-2-ol
- 2 ml Molke aus lactosefreier Milch in 10 ml Propan-2-ol
- 0,2 g Joghurt in 10 ml Propan-2-ol
- 0,1 g Lactose in 10 ml Propan-2-ol (Vergleichslösung)
- 0,1 g Glucose in 10 ml Propan-2-ol (Vergleichslösung)
Mobile Phase: Ethylacetat/Propan-2-ol/Natriumacetat-Lösung (v/v/v = 6,5 /2,4/1,2)
Sprühreagenz: 5 ml Anisaldehyd, 5 ml Schwefelsäure konz., 1 ml Eisessig, 90 ml Ethanol (96 %)
Stationäre Phase:
- Kieselgel Sil/Guv 256
- 6 Bechergläser (50 ml)
- Messpipette (10 ml)
- Heizplatte
- Messpipetten (5 ml, 1 ml)
- Zerstäuber
- Kapillaren
- Chromatografiegefäß
- Trockenschrank
Sicherheit
Schwefelsäure ist ätzend, Schutzbrille tragen.
Durchführung
- Chromatografiegefäß mit der mobilen Phase befüllen und verschließen.
- Oben aufgeführte Lösungen (Proben) herstellen. Eventuell muss auf der Heizplatte erwärmt werden.
- Dünnschichtplatte vorbereiten. Startlinie ca. 1,5 cm vom unteren Rand vorsichtig mit Bleistift und die Auftragungspunkte 1, 2, 3 und 4 im Abstand von ca. 1 cm markieren. Die Beschichtung darf nicht verletzt werden.
- Zweimaliges Auftragen der einzelnen Lösungen (Proben) mit Hilfe einer Kapillare (1 µl). Dazwischen mit dem Fön trocknen.
- Das Chromatogramm wird in das mit mobiler Phase gefüllte Chromatografiegefäß gestellt.
- Wenn die Fließmittelfront den oberen Rand fast erreicht hat, wird die Platte entnommen, die Fließmittelfront markiert und im Abzug getrocknet.
- Nach dem Trocknen wird die Platte gleichmäßig mit dem Sprühreagenz im Abzug besprüht und 10 Minuten im Trockenschrank bei 110 °C entwickelt.
Beobachtung
Ergebnis